เรื่องราวของสองพี่น้องช่างประปาชาวนิวยอร์ก มาริโอ้ และ ลุยจิ ที่ถูกดูดเข้าไปในท่อน้ำลึกลับขณะกำลังซ่อมท่อใต้ดิน ทำให้ทั้งคู่หลุดเข้าไปยังโลกคู่ขนาน แต่มาริโอ้กลับพลัดหลงกับน้องชาย เขาจึงต้องออกเดินทางใน “อาณาจักรเห็ด” โดยได้รับความช่วยเหลือจาก เจ้าหญิงพีช และ โท้ด เพื่อฝึกฝนความกล้าและออกไปช่วยลุยจิจากเงื้อมมือของ บาวเซอร์ ราชาคุปป้าจอมวายร้ายที่วางแผนจะยึดครองโลก